产品货号：
ALH190
中文名称：
miRNA荧光定量PCR检测试剂盒
英文名称：
miRNA fluorescent quantitative PCR detection kit
产品规格：
50μl×50次
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
本试剂盒采用SYBR Green I嵌合荧光法的原理进行miRNA荧光定量检测。本试剂盒包含miRNA荧光定量检测的所有试剂，包括2×miRNA qPCR Mix和Reverse primer。2×miRNA qPCR Mix（含Sybr Green）是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，其中的DNA polymerase采用的是抗体修饰的热启动形式，配合特殊的Buffer体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。
保存：-20℃避光，有效期6个月。
Forward Primer设计原则：
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| 组分 | 规格 |
| 2×miRNA qPCR Mix(With SYBR Green) | 1.25mL |
| 10μM Reverse primer | 55μL |
保存：-20℃避光，有效期6个月。
- 分子生物学实验级别的水（无核酸酶）。
- 待检测miRNA对应的qPCR上游引物（Forward primer）。
Forward Primer设计原则：
- 遵循引物设计的最普遍原则。
- 以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础和最简单的设计方法。
- 试剂盒中提供的下游引物的Tm值为65℃，设计上游引物的Tm值要尽量保证在65℃左右。
- 若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基（最好为G或C碱基）；也可以在3’端添加1个或几个A碱基；或者5’端和3’端同时修饰。
- 若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。
- 使用前充分融解混匀。2×miRNA qPCR Mix短期使用可放在4℃，避免反复冻融。Reverse primer每次用完置-20℃保存。
- miRNA第一链cDNA的加入量不要超过real time PCR体积1/10。
- 对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA（10倍或者100倍）。
- 本品中含有荧光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
- 2×miRNA qPCR Mix不含参比染料ROX，客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX参比染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
- 本试剂盒须与 miRNA荧光定量检测试剂盒（ALH189）配套使用。
- 在室温融化2 x miRNA qPCR Mix和Reverse primer（10μM）。
- 使用时请将2 x miRNA qPCR Mix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。注：请不要使用振荡器混匀。
- 按照下表组分冰上进行反应液的配制。
成分 50μL体系 20μL体系 终浓度 2×miRNA qPCR Mix(With SYBR Green) 25μL 10μL 1× 10μM Forward primer 1μL 0.4μL 0.2μM 10μM Reverse primer 1μL 0.4μL 0.2μM miRNA第一链cDNA x μl x μL - ddH2O 至50μL 至20μL - - PCR程序设置
提高特异性选择两步法。提高扩增效率选择三步法。- PCR循环（三步法）
温度 时间 循环数 94℃ 2～3min 1 94℃ 10～20sec 35～45 55～65℃ 10～20sec 72℃ 20～60sec Dissociation Stage - PCR循环（二步法）
温度 时间 循环数 94℃ 2～3min 1 94℃ 15～20sec 35～45 60℃ 40sec Dissociation Stage
- PCR循环（三步法）
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